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ASFV核酸檢測PCR異常曲線問題解析

2022-05-20 9792人閱讀 來源：


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問題匯總


1 ? 檢測結(jié)果出現(xiàn)“翹尾”的原因是什么，該如何處理？

答：在PCR擴(kuò)增過程中會出現(xiàn)兩種翹尾情況，一種是陰性對照出現(xiàn)翹尾，基本可以判定為陽性質(zhì)控或者陽性樣本污染導(dǎo)致；另外一種是樣品出現(xiàn)翹尾。如果樣品呈現(xiàn)翹尾現(xiàn)象，則有可能是由于陽性污染、非特異性擴(kuò)增和目的基因濃度低。其中，非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)的翹尾主要是因為某些試劑盒生產(chǎn)廠家使用的引物、探針不合理，生產(chǎn)工藝不達(dá)標(biāo)，特點是樣品出現(xiàn)大面積翹尾現(xiàn)象。
如果只是個別樣品出現(xiàn)翹尾，可以按照以下步驟處理①、將原樣本和重新采集豬場樣品進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢仍然翹尾，判為低濃度病毒陽性。②、如果復(fù)檢都為陰性，則有可能是實驗室存在氣溶膠污染，就要對實驗室進(jìn)行全面的通風(fēng)、消毒處理，消殺后對環(huán)境、設(shè)備、耗材等進(jìn)行PCR檢測，檢驗消殺效果。


2 ? 陽性對照或陽性樣本不顯示CT值及解決方案。

答：1）若陽性對照擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型曲線，但結(jié)果不顯示CT值，出現(xiàn)這種情況的主要原因是儀器自動閾值線過高或過低。解決方案：通過手動調(diào)節(jié)閾值線解決此問題，閾值線一般設(shè)置在陽性對照擴(kuò)增的起始，并高于陰性對照曲線。
2）若陽性對照沒有擴(kuò)增曲線，原因包括①、陽性對照未充分溶解或者陽性對照降解。解決方案：A、等陽性對照完全溶解后再進(jìn)行實驗。B、打開新的陽性對照進(jìn)行實驗，若新的陽性對照沒有問題，表示舊的陽性對照降解。②、PCR反應(yīng)液存在降解。解決方案：打開新的PCR反應(yīng)液，使用同一陽性對照做交叉實驗，若新的PCR反應(yīng)液沒有問題，表示舊的PCR反應(yīng)液降解。


3 ? PCR管蓋未蓋嚴(yán)，導(dǎo)致里面的液體蒸發(fā)，是否會產(chǎn)生氣溶膠，導(dǎo)致環(huán)境污染？

答：陽性質(zhì)控品和擴(kuò)增后的陽性樣本含有大量的目的基因片段，探針法熒光PCR的目的片段大小一般介于60-150bp之間，質(zhì)量很小，容易隨液體蒸發(fā)揮發(fā)到空氣當(dāng)中，形成氣溶膠。積累到一定的程度，會對環(huán)境造成污染，在下次做PCR實驗時，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此在實驗之前一定要將管蓋蓋緊，同時對于新批次的PCR管，建議做氣密性檢測，防止氣密性不嚴(yán)導(dǎo)致環(huán)境污染。


4 ? 非洲豬瘟檢測結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀？

答：非洲豬瘟檢測結(jié)果和臨床診斷不符合的原因主要有：
①、豬只處于感染初期的窗口期或者間歇性排毒期，在采樣時未能采集到病毒。
②、采樣是否具有代表性，若采集的樣本沒有代表性，會造成結(jié)果的假陰性，如對活豬盡量采集喉部拭子及抗凝血，病死豬采集脾臟和淋巴結(jié)，同時使用含內(nèi)源基因的非洲豬瘟病毒試劑盒監(jiān)測采樣有效性。
③、送樣過程中長時間未使用冷藏運(yùn)輸造成病毒降解，檢測人員處理樣本時未充分混勻等均可造成假陰性結(jié)果。

5 ? 非洲豬瘟熒光PCR檢測過程中，熒光抑制物有哪些？

答：整個PCR反應(yīng)過程中，主要涉及核酸提取和PCR擴(kuò)增兩個環(huán)節(jié)，采集的樣本中含有許多成分會影響PCR反應(yīng)進(jìn)程，包括病毒的提取效率、聚合酶的活性和病毒的穩(wěn)定性。主要的抑制物有內(nèi)源性和外源性兩種
①、內(nèi)源性：天然純正于標(biāo)本中的標(biāo)本組成成分，如免疫球蛋白、蛋白酶、血紅蛋白、脂類、黏蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。
②、外源性：肝素抗凝劑、纖維素、硝酸纖維素，過度紫外照射的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上的含有的抑制物。


6 ? 放置PCR管時沒有配平，是否會對儀器及結(jié)果產(chǎn)生影響？

答：①、配平的主要目的是讓熱蓋壓在pcr管壓力、受熱均勻，若經(jīng)常不配平，會導(dǎo)致熱蓋傾斜，容易損壞儀器，建議按照儀器廠家要求進(jìn)行操作。②、不配平短期內(nèi)對結(jié)果無影響，若長期熱蓋傾斜，受熱不均，有可能會導(dǎo)致結(jié)果異常。


7 ? 檢測結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)CT值小于10的情況，該如何解讀？

答：首先先看擴(kuò)增曲線是否正常，如果正常，代表病毒濃度較高。如果擴(kuò)增曲線異常，需要分析具體是哪類異常曲線導(dǎo)致的，其中斜直線是最常見的曲線異常，出現(xiàn)這種情況可以通過調(diào)節(jié)基線和閾值線解決。


8 ? 如果懷疑空氣中有氣溶膠污染，如何采集空氣中的樣本呢？

答：在未污染的實驗室內(nèi)取適量的PCR八聯(lián)管，每個管內(nèi)加入25微升PCR反應(yīng)液，將PCR管打開蓋子放置在懷疑有污染的實驗室不同位置，半個小時后再蓋上蓋子進(jìn)行擴(kuò)增。若出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則說明空氣中存在氣溶膠污染。

9 ? 同一個樣本，第一次檢測為陽性，然后進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果為陰性，這種情況該如何解讀？

答：此情況一般出現(xiàn)在弱陽性樣本中。對于弱陽性樣本，存在著泊松分布，每次吸到的病毒含量均不同，甚至沒有吸到病毒，因此存在復(fù)測時平行結(jié)果不一致的情況。另外對于環(huán)境樣本等弱陽性樣本，放置時間長，核酸容易出現(xiàn)降解，也會出現(xiàn)復(fù)測時平行結(jié)果不一致的情況。出現(xiàn)此情況，建議重新采樣進(jìn)行檢測，同時做三個平行，若有一個陽性，則判定為陽性。

10 ? 實驗結(jié)果陰性對照是陽性，一般是什么原因？

答：陰性對照出現(xiàn)陽性，若曲線正常，則表示環(huán)境存在污染，需要對實驗室進(jìn)行清潔。若曲線是斜直線，考慮PCR反應(yīng)液蒸發(fā)或者掛壁、PCR管不干凈等因素。


11 ? 實驗上機(jī)結(jié)束后，八連管中有絮狀物產(chǎn)生，是什么原因會出現(xiàn)這種情況？

答：若血液樣本使用免提取方法進(jìn)行操作，因里面含有蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，會導(dǎo)致絮狀物的產(chǎn)生。若經(jīng)過核酸提取后還存在絮狀物，表明核酸提取過程中雜質(zhì)未去除干凈。


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